洋蔥(cong)亞細(xi)(xi)胞(bao)(bao)定位(wei)(wei) 如何定位(wei)(wei)重要細(xi)(xi)胞(bao)(bao)器 亞細(xi)(xi)胞(bao)(bao)定位(wei)(wei)辦法就是用來(lai)肯定細(xi)(xi)胞(bao)(bao)內分子(zi)在細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)的(de)(de)位(wei)(wei)置的(de)(de)一(yi)種辦法。如何使用熒(ying)光(guang)顯微鏡技術來(lai)定位(wei)(wei)洋蔥(cong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)的(de)(de)一(yi)些(xie)重要細(xi)(xi)胞(bao)(bao)器。

植(zhi)物(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)是(shi)由許多不同(tong)的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)器組成(cheng)的，這些細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)器在細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內(nei)扮(ban)演著不同(tong)的角色。為了研究(jiu)這些細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)器的功能和位置，科學家們(men)(men)(men)使用(yong)各(ge)種技術來(lai)對它們(men)(men)(men)進行(xing)定位。其中一種常用(yong)的技術是(shi)熒光顯(xian)微鏡技術，它可(ke)以通過標(biao)記特(te)定的蛋白質或化合物(wu)來(lai)觀察它們(men)(men)(men)在細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內(nei)的位置。

什么是亞細胞定位？首先我們來看什么是亞細胞。細胞是構成生物體的基本結構單位和功能單位，是生命的物質基礎。細胞的結構復雜精巧且高度有序，亞細胞是比細胞結構更細化的結構，根據功能和空間分布的不同，細胞內部可以進一步劃分為不同的細胞區域或細胞器，雙分子熒光互補技術，即亞細胞，其結構一般只有在電子顯微鏡(EMs)下才能看到。它們的特點是在細胞內，功能和空間相互隔離，又共同協調維持完整的細胞功能。在一定范圍內，亞細胞結構等同于細胞器，不過像細胞膜雖然可以叫亞細胞結構，但不是細胞器。每種亞細胞結構中都存在一組特定的蛋白質，亞細胞結構為這些蛋白質行使功能提供了相對獨立的生命活動場所。同時也只有在相同或相近的亞細胞位置上蛋白質間才會有相互作用。

亞細胞定位操作步驟

1、通過(guo)一些在(zai)線網站預測亞細胞定(ding)位(wei)

2、亞(ya)細胞定(ding)位載體構建

（1）引(yin)物(wu)設計(ji)：利用引(yin)物(wu)設計(ji)軟件，根據pEGP-MCS-N1或pEGP-C1-MCS的(de)(de)酶(mei)切位點設計(ji)目的(de)(de)基因引(yin)物(wu)。

（2）載(zai)體(ti)構建：將PCR產物酶切(qie)后插入(ru)pEGP-MCS-N1或(huo)pEF-C1-MCS，得到表達目的基因與EGP融(rong)合蛋(dan)白質的真(zhen)核(he)表達載(zai)體(ti)。

3、細胞轉染

當細(xi)胞(bao)(bao)生長(chang)到(dao)對數(shu)生長(chang)期時(shi)，接種到(dao)共(gong)(gong)聚焦(jiao)顯(xian)微鏡(jing)的(de)玻(bo)璃底培養皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培養過夜。當細(xi)胞(bao)(bao)貼(tie)壁率(lv)達到(dao)30%~50%時(shi)，將(jiang)融合(he)綠色熒(ying)光蛋白GFP的(de)重組載體質粒(li)和(he)目標(biao)細(xi)胞(bao)(bao)器質粒(li)共(gong)(gong)轉染細(xi)胞(bao)(bao)。37℃孵箱(xiang)培養24~72h。

4、激(ji)光掃描共聚焦顯微鏡觀察

將上述細(xi)胞分別(bie)在24、36、48、72h的時間點，根據實驗(yan)需求選擇(ze)對應激發波長（常(chang)用405nm、488nm和561nm），使用共聚焦顯微鏡(jing)觀(guan)察(cha)，采取圖像(xiang)。

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