和其它實驗方法一樣，必須同時設對照試驗以證明其實驗結果特異性。對照試驗的設置須根據核酸探針和靶核苷酸的種類和現有的可能條件去選定。ISHH的優點是它的高度特異性，它可測定組織、培養的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。應用高敏感度的性標記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mRNA，其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細胞。由于雙鏈DNA的穩定性，在用ISHH定位DNA時很少發生丟失，降解，其敏感性高到能夠顯示在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。正因為如此，對ISHH結果的解釋應持慎重態度，特別是前人未報告過的新發現。

一. 原位雜交天

1. 重新水化和固定

1） 吸取固定好的(de)胚胎，加(jia)入50%的(de)PBST溶液，放置5分鐘。

2） 置(zhi)換成30％的PBST溶(rong)液(ye)，放置(zhi)5分鐘

3） 置換成PBST溶液(ye)，放置5分(fen)鐘，重(zhong)復一次

4） 置換成(cheng)4％多(duo)聚甲(jia)醛的(de)PBS溶液固(gu)定20分鐘(zhong)

5） 用PBST洗兩次(ci)，每(mei)次(ci)放置五(wu)分鐘，室溫。

 蛋(dan)白酶處(chu)理(li)與后固(gu)定（本實(shi)驗不(bu)做此步）

1） 用(yong)(yong)10ul/ml的(de)(de)蛋(dan)白酶(mei)K在室溫下(xia)處(chu)理(li)胚(pei)胎(tai)。5體節以(yi)(yi)下(xia)的(de)(de)胚(pei)胎(tai)不(bu)(bu)處(chu)理(li)，5體節到24小時的(de)(de)胚(pei)胎(tai)處(chu)理(li)3分鐘，24小時以(yi)(yi)上的(de)(de)胚(pei)胎(tai)處(chu)理(li)5分鐘或者(zhe)更長(chang)。發(fa)育(yu)時間越(yue)短的(de)(de)胚(pei)胎(tai)越(yue)嫩，可以(yi)(yi)不(bu)(bu)用(yong)(yong)或者(zhe)少用(yong)(yong)蛋(dan)白酶(mei)處(chu)理(li)，發(fa)育(yu)時間長(chang)的(de)(de)胚(pei)胎(tai)就需(xu)要用(yong)(yong)蛋(dan)白酶(mei)來疏(shu)松組織，以(yi)(yi)便于(yu)雜交。

2） 用PBST溶液(ye)輕洗，在PBST中放(fang)置5分鐘。

3） 用4％多聚甲醛(quan)的PBS溶液固定20分鐘，室(shi)溫。

4） 用(yong)PBST洗(xi)兩次，每次放(fang)置(zhi)五(wu)分鐘，室溫。

熒光(guang)原位雜交(jiao)（FISH）技術具(ju)有以下(xia)優點：

可(ke)多重染(ran)(ran)色：利用(yong)不(bu)同的熒(ying)光染(ran)(ran)料(liao)標記不(bu)同的探針(zhen)，GISH，可(ke)以實(shi)現多重熒(ying)光原位雜交，從而同時檢測(ce)多個序列，提(ti)高(gao)實(shi)驗(yan)效率(lv)了。

高度創新性和性：FISH技術不僅可以用于研究已知基因或序列的染色體定位，還可以用于未基因或遺傳標記及染色體畸變的研究，在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。

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