為(wei)什么有(you)的基因定(ding)位結果與預想(xiang)的不一(yi)致(zhi)？

對于(yu)一個特定(ding)(ding)的定(ding)(ding)位載體(ti)，只要熒光表(biao)達較好，BIFC，其(qi)定(ding)(ding)位結果是(shi)確定(ding)(ding)的，不(bu)會隨人為意愿或操作而改變。至于(yu)有時(shi)候和(he)預(yu)想的結果不(bu)一樣，可能(neng)和(he)蛋(dan)白本身、選(xuan)擇的表(biao)達載體(ti)以及熒光蛋(dan)白融合方(fang)式等有關(guan)。

為什(shen)么有(you)的(de)普通定位結果出來后無(wu)法(fa)準確判(pan)斷(duan)其定位位置？

細胞中的細胞器復雜且多樣，除一些常見的、特征比較明顯的細胞器外，有些細胞器在激光共聚焦下形狀比較相似，例如：線粒體、過氧化物酶體、高爾基體等細胞器，它們的熒光表達形狀可能都是點狀，因此不易區分。這時可以結合基因的其他功能研究來判斷其可能表達的位置。另外，蛋白表達本身也是一個復雜的過程，涉及到多個合成場所及轉運過程，自身表達情況可能比較復雜，因此不易判斷具體的表達位置。

為什(shen)么(me)不(bu)先對一個基因做(zuo)預測(ce)(ce)，在預測(ce)(ce)的結(jie)果上直接做(zuo)共定位？

不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)預(yu)測網站有(you)(you)不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)計(ji)算(suan)方(fang)法，同(tong)一個基(ji)因(yin)在(zai)不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)預(yu)測網站也(ye)可(ke)能得出不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)定位結果。另外所有(you)(you)的(de)(de)(de)結果都應是基(ji)于實驗得到(dao)的(de)(de)(de)，對于不(bu)(bu)清楚(chu)可(ke)能定位在(zai)哪里的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)，一般(ban)推薦先做普(pu)通(tong)定位，根據普(pu)通(tong)定位的(de)(de)(de)結果再決定做哪種細胞器(qi)的(de)(de)(de)共定位。

為什么(me)有的基因做原生質體轉化時(shi)熒光(guang)蛋白(bai)不亮？

不同物種的細胞可能對基因表達有影響(xiang)，當在(zai)一(yi)種材料的原生(sheng)質體中觀察不到熒(ying)光(guang)時(shi)，可以考(kao)慮(lv)換(huan)一(yi)種受體材料。另外，如(ru)果是分泌蛋白，在(zai)原生(sheng)質體中無法觀察到熒(ying)光(guang)，此時(shi)可以考(kao)慮(lv)注射葉片來觀察熒(ying)光(guang)。

拍(pai)攝時為什么有明(ming)場通道？

（1）顯示(shi)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)狀態(tai)，有活(huo)力的原(yuan)生質體細胞(bao)(bao)(bao)(bao)應該是飽(bao)滿圓潤的，變形或(huo)破碎的細胞(bao)(bao)(bao)(bao)說(shuo)明此時細胞(bao)(bao)(bao)(bao)不是適狀態(tai)或(huo)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)已。

（2）顯示熒光確實是細胞內蛋白表達的，而不是細胞碎片及雜質產生的雜光。

構建(jian)亞(ya)細胞定位載(zai)體時(shi)，GFP融合位置為什么有N端、C端之分？

若序列中(zhong)存在(zai)信號肽，則構建載體(ti)時(shi)需避開這一(yi)端來融(rong)(rong)合(he)熒光蛋(dan)(dan)白。需注意(yi)不(bu)同(tong)的(de)(de)融(rong)(rong)合(he)方式可能會得(de)到(dao)不(bu)同(tong)的(de)(de)定位結果，例如融(rong)(rong)合(he)在(zai)熒光蛋(dan)(dan)白N端的(de)(de)目(mu)標蛋(dan)(dan)白一(yi)般無(wu)法得(de)到(dao)過(guo)氧化物酶體(ti)的(de)(de)定位結果；融(rong)(rong)合(he)在(zai)熒光蛋(dan)(dan)白C端的(de)(de)目(mu)標蛋(dan)(dan)白一(yi)般無(wu)法得(de)到(dao)線粒體(ti)、質體(ti)的(de)(de)定位結果。

為什么不同的受體(ti)材(cai)料有時得到的定位結果(guo)不一樣(yang)？

不(bu)同物種的(de)(de)細胞在翻譯表達基因時，其表達模式和影(ying)(ying)響因子不(bu)同。受(shou)物種差異的(de)(de)影(ying)(ying)響，同一個載體(ti)(ti)在不(bu)同的(de)(de)受(shou)體(ti)(ti)材料中表達的(de)(de)位置可能不(bu)同，因此建(jian)議實驗時盡可能選用與目的(de)(de)基因來源(yuan)相近的(de)(de)受(shou)體(ti)(ti)材料進(jin)行表達。