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武漢貝科新肽科技有限公司
主營：原位雜交,亞細胞定位,蛋(dan)白互作,啟(qi)動子(zi)篩選
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一. 原位雜交天
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入(ru)50%的PBST溶(rong)液，原位雜交技術(shu)，放置(zhi)5分鐘。
2） 置(zhi)換(huan)成30％的PBST溶(rong)液，放置(zhi)5分鐘
3） 置換成(cheng)PBST溶液，放置5分(fen)鐘，重(zhong)復一次(ci)
4） 置換成4％多(duo)聚甲醛的(de)PBS溶液(ye)固定(ding)20分鐘(zhong)
5） 用PBST洗兩次，每次放(fang)置五分鐘，室溫。
蛋(dan)白(bai)酶處理(li)與(yu)后固定（本(ben)實驗不做此步）
1） 用10ul/ml的(de)(de)蛋白酶K在(zai)室溫下處(chu)理(li)胚(pei)胎(tai)(tai)。5體節以(yi)(yi)下的(de)(de)胚(pei)胎(tai)(tai)不(bu)處(chu)理(li)，5體節到(dao)24小(xiao)時(shi)的(de)(de)胚(pei)胎(tai)(tai)處(chu)理(li)3分鐘(zhong)，24小(xiao)時(shi)以(yi)(yi)上的(de)(de)胚(pei)胎(tai)(tai)處(chu)理(li)5分鐘(zhong)或者更長。發育時(shi)間(jian)越(yue)短的(de)(de)胚(pei)胎(tai)(tai)越(yue)嫩，可以(yi)(yi)不(bu)用或者少用蛋白酶處(chu)理(li)，發育時(shi)間(jian)長的(de)(de)胚(pei)胎(tai)(tai)就(jiu)需要(yao)用蛋白酶來疏松(song)組織(zhi)，以(yi)(yi)便于雜交。
2） 用PBST溶(rong)液輕洗(xi)，在PBST中放(fang)置5分鐘(zhong)。
3） 用4％多(duo)聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫(wen)。
4） 用PBST洗兩次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)放置五(wu)分(fen)鐘，室(shi)溫。
組織原(yuan)位(wei)雜交(Tissue in situ hybridization），即原(yuan)位(wei)雜交組織化學(xue)(xue)技術(shu)和(he)原(yuan)位(wei)雜交細胞化學(xue)(xue)技術(shu)
原位雜(za)交技術(shu)的基本原理(li)
利用核(he)酸分子單鏈之(zhi)間有互補(bu)的(de)(de)堿基順序，通過堿基對之(zhi)間非(fei)共價(jia)鍵的(de)(de)形成，出現穩(wen)定的(de)(de)雙(shuang)鏈區，形成雜交的(de)(de)雙(shuang)鏈。
1.兩(liang)條(tiao)核苷(gan)酸單鏈片段，在適(shi)宜的條(tiao)件下(xia)，通過(guo)氫(qing)鍵結合，形成DNA-DNA、DNA一(yi)RNA或(huo)RNA一(yi)RNA雙鍵分(fen)子
2.應用帶有(you)標記的（有(you)性同位素(su)(su)，如3H、35S、32P，熒(ying)光(guang)素(su)(su)、生物(wu)素(su)(su)、等非性物(wu)質)DNA或RNA片段(duan)作為(wei)核酸探針，與組織切片或細胞(bao)內待(dai)測核酸(RNA或DNA）片段(duan)進行雜交
3.用自(zi)顯影(ying)等方(fang)法予以顯示，在光鏡(jing)或電鏡(jing)下觀(guan)察(cha)目的(de)mRNA或DNA的(de)存(cun)在與定(ding)位
用原位雜交術，可(ke)在原位研究細胞合成某種(zhong)多肽或(huo)蛋白質的基因表達(da)。
此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水來探討細胞的功能表達及其調節機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。
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第3年
