將(jiang)32 P標記的雙鏈DNA探針(zhen)于(yu)100℃加熱5分(fen)鐘，迅(xun)速置于(yu)冰浴中(zhong)。單鏈探針(zhen)不必變性(xing)。將(jiang)探針(zhen)加到雜(za)交(jiao)(jiao)袋中(zhong)雜(za)交(jiao)(jiao)過夜。雜(za)交(jiao)(jiao)期間，盛濾膜的容(rong)器應蓋(gai)嚴，以防液體蒸發。

雜交結束后，去除雜交液(ye)，立即于(yu)室(shi)溫把(ba)濾膜(mo)放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液(ye)中，原位雜交技術，輕輕振搖5分鐘，并將濾膜(mo)至少翻轉一次。重復洗 一次，同(tong)時(shi)應(ying)避免(mian)膜(mo)干涸(he)。

68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進行自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。

FISH是原位雜交技術大家族中的一員，因其所用探針被熒光物質標記（間接或直接）而得名，該方法在80年代末 被發明，現已從實驗室逐步進入臨床診斷領域。基本原理是熒光標記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火 溫度下復性；通過熒光顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象（即維持其原位）的前提下對靶核酸進行分析。DNA熒光標記探針是其中常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平 的分析。熒光標記探針不對環境構成污染，靈敏度能得到保障，可進行多色觀察分析，因而可同時使用多個探針，植物原位雜交，縮 短因單個探針分開使用導致的周期過程和技術障礙。

原位雜交第三天

1）        用(yong)(yong)1ml含10％熱滅(mie)清的MABT溶(rong)液(ye)置(zhi)換(huan)(huan)溶(rong)液(ye)，放(fang)置(zhi)搖(yao)床(chuang)上(shang)25分鐘(zhong)，然后用(yong)(yong)1mlMABT置(zhi)換(huan)(huan)，25分鐘(zhong)，原位(wei)雜交公司，再用(yong)(yong)1mlMABT溶(rong)液(ye)置(zhi)換(huan)(huan)，一小時(shi)以上(shang)，原位(wei)雜交，后用(yong)(yong)1mlMABT溶(rong)液(ye)置(zhi)換(huan)(huan)，25分鐘(zhong)。

2）        ;用(yong)1ml 1mM左(zuo)旋米睉(cuo)的Staining buffer洗(xi)三次，每次放(fang)置五分鐘(zhong)。

3）將胚胎轉入十(shi)(shi)六(liu)孔(kong)板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底(di)物(wu)，用之前加5mM左(zuo)旋米唑)，十(shi)(shi)六(liu)孔(kong)板外面包上錫箔紙以避(bi)光，避(bi)免搖動，室溫下顯色(se)。

4）每隔一小時觀察(cha)胚(pei)胎是否開始顯(xian)色

5）將(jiang)顯色完全的胚(pei)胎中的底物吸出，用PBST洗兩三(san)次(ci)后(hou)加上4％多聚(ju)甲醛固定，拍照(zhao)。

6）4C冰箱保存。

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