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染色體(ti)原(yuan)(yuan)位雜交實驗的基(ji)本原(yuan)(yuan)理(li)是(shi)利用特定標記的已知堿基(ji)序(xu)列(lie)的核酸(suan)探針,依據(ju)堿基(ji)互(hu)補配對(dui)原(yuan)(yuan)理(li),植(zhi)物染色體(ti)原(yuan)(yuan)位雜交檢(jian)測(ce)服務(wu),與中(zhong)期染色體(ti)玻片標本中(zhong)的同源 DNA 序(xu)列(lie)進行雜交。
標記可以(yi)用放(fang)(fang)1射(she)性(xing)(xing)同(tong)位素(3H、35S、32P),然(ran)后進(jin)行放(fang)(fang)1射(she)自顯(xian)(xian)影;也可以(yi)用非放(fang)(fang)1射(she)性(xing)(xing)的熒光素生物素、地(di)1高辛,再(zai)用熒光顯(xian)(xian)微(wei)鏡進(jin)行觀察,即熒光原位雜交(fluorescent in situhybridization,FISH)技術。
原位雜交第三天
1) 用(yong)(yong)(yong)1ml含10%熱(re)滅清(qing)的MABT溶液置(zhi)(zhi)(zhi)換(huan)溶液,放置(zhi)(zhi)(zhi)搖床(chuang)上(shang)25分(fen)鐘,然后(hou)用(yong)(yong)(yong)1mlMABT置(zhi)(zhi)(zhi)換(huan),25分(fen)鐘,再用(yong)(yong)(yong)1mlMABT溶液置(zhi)(zhi)(zhi)換(huan),一小時以上(shang),后(hou)用(yong)(yong)(yong)1mlMABT溶液置(zhi)(zhi)(zhi)換(huan),25分(fen)鐘。
2) 用(yong)1ml 1mM左(zuo)旋米睉的(de)Staining buffer洗三次,每次放置五分鐘(zhong)。
3)將胚胎轉(zhuan)入十六孔(kong)板(ban)中,吸去staining buffer,加上300ul BM Purple AP Substrate(底物,用(yong)之前加5mM左(zuo)旋米唑),十六孔(kong)板(ban)外面包上錫箔(bo)紙以避(bi)(bi)光(guang),避(bi)(bi)免搖(yao)動,室溫下顯色。
4)每(mei)隔一小(xiao)時觀(guan)察(cha)胚胎(tai)是否開(kai)始顯色
5)將顯色完全的胚胎中的底物(wu)吸(xi)出,用PBST洗兩(liang)三次后(hou)加上4%多聚甲醛固定,拍(pai)照(zhao)。
6)4C冰箱保存。
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