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阻斷內源性過氧化物酶:滴加3%1甲1醇-H2O2,室(shi)溫避光孵育(yu)15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗(xi)滌3次,每次5min。
預雜(za)交(jiao):滴加預雜(za)交(jiao)液,37°C孵(fu)育1h。
雜交(jiao):傾去預雜交(jiao)液,滴(di)加含探針(zhen)has-circ-ST6GALNAC6 probe 雜交(jiao)液,濃(nong)度6ng/ul,恒溫箱37度雜交(jiao)過夜。
雜交(jiao)后洗滌:洗去雜交(jiao)液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若(ruo)非特異雜交(jiao)體(ti)較(jiao)多,可以增加甲酰胺洗滌。
滴加封閉液(ye):滴加封閉血1清(正常兔血1清),室溫30min。
滴加鼠抗地(di)1高辛標(biao)記過氧化物酶(anti-DIG-HRP):傾(qing)去封閉液(ye),滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min,后PBS洗3次(ci)×5min。
意義
在研究DNA分子原理的基礎上發展起來的一種技術。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段,在適宜的條件下,能過氫鍵結合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子的特點,應用帶有標記的(有性同位素,如3H、35S、32P、熒光素生物素、等非性物質)DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細胞內待測核酸(RNA或DNA)片段進行雜交,然后可用自顯影等方法予以顯示,在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在并定位;用原位雜交技術,可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性,可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調節機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。
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