原位雜交第二天

1.

1）將探針回收，原(yuan)位雜交檢(jian)測(ce)，放于－20C保存(通(tong)常(chang)探針可重復使用十次左右)。

2）加入(ru)50%甲酰胺/2XSSCT溶(rong)液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復一次。

3）置換2XSSCT1ml，染色(se)體(ti)熒光原位雜交(jiao)，60℃，放置15分鐘(zhong)。

4）置(zhi)換0.2XSSCT1ml，60℃，放置(zhi)30分鐘，重復一次。

2.

1）用MABT洗(xi)兩次(ci)，每次(ci)五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dong)。

2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時間為一(yi)小時。

3）按(an)1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連，4C 冰箱過(guo)夜(ye)。

核酸原(yuan)位雜(za)交可根據其(qi)檢測物(wu)而分為(wei)細胞內原(yuan)位雜(za)交和組織(zhi)切片內原(yuan)位雜(za)交；根據其(qi)所用探針及所要檢測核酸的(de)不(bu)(bu)同又可分為(wei)DNA-DNA， RNA-DNA， RNA-RNA雜(za)交。但不(bu)(bu)論哪種雜(za)交都必(bi)須經過組織(zhi)細胞的(de)固定，預雜(za)交，雜(za)交，沖等一系列洗步驟(zou)及自顯影或酶法顯色以顯示雜(za)交結果。

我們在這兒介紹的是整胚原位雜交，不同于一般的在載片上對細胞和組織切片進行探針雜交及檢測的原位雜交，

組(zu)織(zhi)原(yuan)位雜(za)交(jiao)(Tissue in situ hybridization），即原(yuan)位雜(za)交(jiao)組(zu)織(zhi)化(hua)(hua)學技(ji)術(shu)和(he)原(yuan)位雜(za)交(jiao)細胞化(hua)(hua)學技(ji)術(shu)

原位雜交技術的基(ji)本原理(li)

利(li)用(yong)核酸分子單鏈(lian)之間有互補的(de)堿基順序，通過堿基對(dui)之間非(fei)共價鍵的(de)形成(cheng)，出現穩(wen)定的(de)雙鏈(lian)區，形成(cheng)雜交的(de)雙鏈(lian)。

1.兩條(tiao)核(he)苷酸單鏈片(pian)段(duan)，熒光原位雜交，在適宜的條(tiao)件下，通(tong)過氫鍵結合(he)，形(xing)成DNA-DNA、DNA一(yi)RNA或(huo)RNA一(yi)RNA雙鍵分子(zi)

2.應用帶(dai)有(you)標記的（有(you)性同位(wei)素，如3H、35S、32P，原位(wei)雜交(jiao)，熒光(guang)素、生(sheng)物(wu)素、等非性物(wu)質)DNA或RNA片(pian)段作為核酸探針，與組織切(qie)片(pian)或細胞內(nei)待測核酸(RNA或DNA）片(pian)段進行雜交(jiao)

3.用自顯(xian)影等方法予(yu)以(yi)顯(xian)示，在光(guang)鏡或(huo)電鏡下觀察目的(de)mRNA或(huo)DNA的(de)存(cun)在與定位

用原位雜交術，可在原位研究細胞合成某(mou)種多肽(tai)或(huo)蛋(dan)白質的基因表達。

此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水來探討細胞的功能表達及其調節機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。