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先生: |
一. 原位雜交天
1. 重新(xin)水(shui)化和固(gu)定
1) 吸取(qu)固定好(hao)的胚(pei)胎,加入50%的PBST溶液(ye),放(fang)置(zhi)5分(fen)鐘。
2) 置換(huan)成30%的PBST溶液(ye),放置5分鐘(zhong)
3) 置(zhi)換成PBST溶液,放置(zhi)5分鐘,重復一次
4) 置換(huan)成4%多聚甲醛(quan)的PBS溶液固(gu)定20分(fen)鐘(zhong)
5) 用(yong)PBST洗兩(liang)次,每次放置五(wu)分鐘,室溫。
蛋白酶處理(li)與(yu)后(hou)固(gu)定(本實驗不做此步)
1) 用(yong)10ul/ml的(de)蛋白酶K在(zai)室溫下處(chu)理胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)。5體(ti)節以(yi)下的(de)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)不(bu)處(chu)理,染色體(ti)原(yuan)位雜(za)交,5體(ti)節到24小(xiao)時(shi)的(de)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)處(chu)理3分鐘,24小(xiao)時(shi)以(yi)上的(de)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)處(chu)理5分鐘或者(zhe)更(geng)長(chang)(chang)。發育時(shi)間越短的(de)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)越嫩,可以(yi)不(bu)用(yong)或者(zhe)少用(yong)蛋白酶處(chu)理,發育時(shi)間長(chang)(chang)的(de)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)就需要用(yong)蛋白酶來疏(shu)松組織,以(yi)便于(yu)雜(za)交。
2) 用PBST溶液輕洗,在PBST中放置5分鐘(zhong)。
3) 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定(ding)20分鐘,室(shi)溫。
4) 用(yong)PBST洗兩(liang)次(ci),每次(ci)放置五分鐘,原位雜交,室溫。
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