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原位雜交天
1. 重新水(shui)化和固定
1) 吸取(qu)固定(ding)好(hao)的(de)胚胎,加(jia)入50%的(de)PBST溶(rong)液,放置5分鐘。
2) 置換成30%的(de)PBST溶液,放置5分鐘
3) 置換成PBST溶液,放置5分鐘,植(zhi)物組織原位雜(za)交檢(jian)測(ce)技(ji)術服務(wu),重復(fu)一次
4) 置換成4%多聚甲(jia)醛的PBS溶液(ye)固定20分(fen)鐘5) 用PBST洗(xi)兩次,每次放(fang)置五(wu)分(fen)鐘,室溫(wen)。
蛋白(bai)酶處理與后固(gu)定(本實驗不做(zuo)此步)
1) 用10ul/ml的蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)K在(zai)室溫下處(chu)理胚胎(tai)。5體(ti)(ti)節(jie)(jie)以下的胚胎(tai)不(bu)處(chu)理,5體(ti)(ti)節(jie)(jie)到24小時(shi)的胚胎(tai)處(chu)理3分鐘(zhong),24小時(shi)以上的胚胎(tai)處(chu)理5分鐘(zhong)或(huo)者更長(chang)。發育(yu)時(shi)間(jian)越短的胚胎(tai)越嫩,可以不(bu)用或(huo)者少用蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)處(chu)理,發育(yu)時(shi)間(jian)長(chang)的胚胎(tai)就需要(yao)用蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)來疏松組織,以便于雜交(jiao)。
2) 用PBST溶液輕洗(xi),在PBST中放置5分鐘。
3) 用4%多聚甲醛(quan)的PBS溶(rong)液(ye)固定20分鐘,室溫。
4) 用(yong)PBST洗兩次(ci),每次(ci)放置五分鐘,室溫。
2. 預雜交
1)每個(ge)管中置換成大約300ulHYB-溶液,60℃水浴5分鐘(zhong),避(bi)免振蕩。
2)用等(deng)體積(ji)的HYB+取代HYB-。
3)60℃水(shui)浴(yu),預雜交(jiao)4小時以上(shang)。
3. 雜交
1)吸去預雜交的HYB+,加上100ul已加入探針(zhen)的HYB+溶(rong)液(探針(zhen)濃度約為(wei)1ng/ul)..
2)60℃ 溫(wen)(wen)浴過(guo)夜。注(zhu):雜交與(yu)預雜交的溫(wen)(wen)度(du)可以是55到60度(du)不等,溫(wen)(wen)度(du)越低,探針結合越好,溫(wen)(wen)度(du)越高(gao),背景(jing)越小。
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