原(yuan)位雜(za)交(jiao)是一種非常(chang)重要的(de)技術，因(yin)為它(ta)可以在(zai)細(xi)胞(bao)或組織(zhi)的(de)自然環境中研究基因(yin)表達和(he)調(diao)控。它(ta)可以幫助科學家們(men)了解基因(yin)在(zai)特定(ding)組織(zhi)或細(xi)胞(bao)類型中的(de)作用(yong)和(he)功能，以及在(zai)疾病發(fa)生和(he)發(fa)展過程中的(de)變(bian)化。此外，這項(xiang)技術還可以用(yong)于檢(jian)測(ce)(ce)基因(yin)變(bian)異(yi)(yi)和(he)染(ran)色體異(yi)(yi)常(chang)，以及監測(ce)(ce)細(xi)胞(bao)生長和(he)凋亡。

雖然原位雜交(jiao)是一項(xiang)非常有(you)用的技(ji)術，但它也有(you)一些限制。首先(xian)，探針的特異性可能受到(dao)干擾，導致錯(cuo)誤的結(jie)(jie)果。其次，探針的數(shu)量和(he)(he)位置可能受到(dao)細胞(bao)或(huo)組織中其他成(cheng)分的影響。此(ci)外(wai)，這(zhe)項(xiang)技(ji)術的操作(zuo)比較繁瑣，需(xu)要專(zhuan)門的技(ji)術和(he)(he)設(she)備，熒光(guang)原位雜交(jiao)，而且(qie)需(xu)要大量的實驗(yan)和(he)(he)對照才能獲得可靠的結(jie)(jie)果。

菌落(luo)的裂解及DNA結合于(yu)纖維素濾膜

（1） 在一張保鮮膜(mo)上(shang)(shang)制(zhi)作一個裝有0.5mol/L NaOH的小洼(wa)（0.75ml），使菌(jun)落面朝上(shang)(shang)，將濾(lv)膜(mo)放到小洼(wa)上(shang)(shang)，展平保鮮膜(mo)，使濾(lv)膜(mo)均(jun)勻濕潤，讓濾(lv)膜(mo)留于原處2-3分鐘(zhong)。

（2） 用干(gan)紙(zhi)巾從濾膜(mo)的(de)下方(fang)吸干(gan)濾膜(mo)，用一張新的(de)保(bao)鮮膜(mo)和新配制的(de)0.5mol/L NaOH重(zhong)復步(bu)驟（1）。

（3） 吸干濾(lv)膜(mo)，將濾(lv)膜(mo)轉移到新的(de)帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的(de)保(bao)鮮膜(mo)洼(wa)上(shang)。5分鐘后吸干濾(lv)膜(mo)，再(zai)重復一次(ci)該步驟。

（4） 吸干濾(lv)膜，把它轉移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4）的(de)保鮮膜小洼上5分鐘(zhong)后吸干濾(lv)膜，轉移到一(yi)張干的(de)濾(lv)紙(zhi)上，置于室溫20-30分鐘(zhong)，使(shi)濾(lv)膜干燥。

（5） 將濾(lv)膜夾(jia)在兩張干的濾(lv)紙(zhi)之間(jian)，原位(wei)雜交檢測(ce)，在真空烤箱中于80℃干烤2小時，固定DNA。

（6） 將固定在膜上的DNA與32 P標記的RNA進行雜交。

在ISHH，整個實驗周期是比較長的，染色體熒光原位雜交，實驗程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個實驗中可被認為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細胞或組織與其內的靶核苷酸相結合。因此，雜交是ISHH中關鍵的而且是重要的一個環節。雜交是將雜交液滴于切片組織上，原位雜交，加蓋硅化的蓋玻片，防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導致雜交液的蒸發。為保證雜交所需的濕潤環境，可將其放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate， SSC）溶液的硬塑料盒中進行孵育。雜交液的成分和預雜交液基本相同，所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖。

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