在ISHH，湖北原位雜交，整個實驗周期是比較長的，實驗程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個實驗中可被認為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細胞或組織與其內的靶核苷酸相結合。因此，雜交是ISHH中關鍵的而且是重要的一個環節。雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導致雜交液的蒸發。為保證雜交所需的濕潤環境，可將其放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate， SSC）溶液的硬塑料盒中進行孵育。雜交液的成分和預雜交液基本相同，所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖。

以(yi)(yi)菌(jun)落原(yuan)(yuan)位雜(za)交為例：對分散在若(ruo)干(gan)個瓊脂(zhi)平(ping)板(ban)(ban)上的(de)少數(shu)菌(jun)落（100-200）進行篩選時，原(yuan)(yuan)位雜(za)交檢(jian)測，可采用(yong)該(gai)方法。將這些(xie)菌(jun)落歸并到一(yi)個瓊脂(zhi)主(zhu)平(ping)板(ban)(ban)以(yi)(yi)及已(yi)置于第二個瓊脂(zhi)平(ping)板(ban)(ban)表面的(de)一(yi)張(zhang)纖維(wei)素(su)濾(lv)膜上。經培養一(yi)段時間(jian)后，對菌(jun)落進行原(yuan)(yuan)位裂解。主(zhu)平(ping)板(ban)(ban)應(ying)貯存于4℃直(zhi)至得到篩選結果。

將少數菌落轉(zhuan)移到纖維素(su)濾膜(mo)上(shang)

（1） 在含有選(xuan)擇性的瓊脂(zhi)平板上放一張纖維素(su)濾膜。

（2） 用(yong)無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuan)移至(zhi)濾膜(mo)上，再(zai)轉(zhuan)移至(zhi)含(han)有選擇性(xing)但未放濾膜(mo)的瓊脂主平板(ban)上。應按一(yi)定(ding)的格子(zi)進行劃線接種（或打點）。每菌落應分(fen)別(bie)劃線于兩(liang)個平板(ban)的相同位(wei)置(zhi)上。后，染色體熒光原(yuan)位(wei)雜(za)交(jiao)，在(zai)濾膜(mo)和主平板(ban)上同時劃一(yi)個含(han)有非重組質粒的菌落。

（3） 倒置(zhi)平板，于37℃培(pei)養(yang)至劃線的細菌(jun)菌(jun)落生長到(dao)0.5-1.0mm的寬度。

（4） 用(yong)已裝防水黑色繪圖墨水的(de)針頭穿透濾膜直至瓊脂，在(zai)3個以上(shang)的(de)不對稱位(wei)置作標記(ji)。在(zai)主平(ping)板大致相同(tong)的(de)位(wei)置上(shang)也作上(shang)標記(ji)。

（5） 用Parafilm膜封(feng)好主平板，倒置(zhi)貯放于4℃，直至(zhi)獲(huo)得雜交反應的結果(guo)。

（6） 裂解細菌，按本段下面所述方法，使釋放的(de)DNA結(jie)合于纖維素濾膜。

原(yuan)位雜交技術的原(yuan)理是什么？有何(he)用途

原位雜交技術的(de)(de)原理是利用核酸分子(zi)單鏈之(zhi)間(jian)有(you)(you)互(hu)補的(de)(de)堿基序(xu)列，將(jiang)有(you)(you)性或(huo)(huo)(huo)非性的(de)(de)外源核酸(即探針(zhen))與組(zu)織、細(xi)胞或(huo)(huo)(huo)染色(se)體上待測DNA或(huo)(huo)(huo)RNA互(hu)補配對，結(jie)合成專一(yi)的(de)(de)核酸雜交分子(zi)，經一(yi)定(ding)的(de)(de)檢測手段(duan)將(jiang)待測核酸在組(zu)織、細(xi)胞或(huo)(huo)(huo)染色(se)體上的(de)(de)位置(zhi)顯示出(chu)來。為顯示特定(ding)的(de)(de)核酸序(xu)列要具(ju)備3個重要條件：組(zu)織、細(xi)胞或(huo)(huo)(huo)染色(se)體的(de)(de)固定(ding)、具(ju)有(you)(you)能與特定(ding)片段(duan)互(hu)補的(de)(de)核苷酸序(xu)列(即探針(zhen))、有(you)(you)與探針(zhen)結(jie)合的(de)(de)標記物(曾呈奎等2000)。

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