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GFP是(shi)綠色(se)(se)熒光(guang)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai),在(zai)掃描共聚(ju)焦顯(xian)微鏡的(de)激光(guang)照射下會發出(chu)(chu)綠色(se)(se)熒光(guang),從而可以地定(ding)(ding)位(wei)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質的(de)位(wei)置。綠色(se)(se)螢光(guang)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)(GFP)是(shi)一個由約238個氨基(ji)酸組成(cheng)的(de)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)質,從藍光(guang)到紫外線都能(neng)使(shi)其激發,湖北亞(ya)細(xi)(xi)胞定(ding)(ding)位(wei),發出(chu)(chu)綠色(se)(se)熒光(guang)。通過基(ji)因工程(cheng)技(ji)術,綠色(se)(se)螢光(guang)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)(GFP)基(ji)因能(neng)轉(zhuan)進不同(tong)物種(zhong)的(de)基(ji)因組,在(zai)后代中持續表(biao)(biao)達(da),蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)亞(ya)細(xi)(xi)胞定(ding)(ding)位(wei),并且能(neng)根據(ju)啟動(dong)子特(te)異(yi)性地表(biao)(biao)達(da)。
使用GFP必須構建融合蛋白載體,并在轉染之后有效表達。這樣,若在熒光顯微鏡下看到細胞內某一部位存在GFP信號,說明和GFP融合的蛋白也存在于該部位,這樣就達到了確定某物質亞細胞定位的目的。
洋(yang)蔥亞(ya)細胞定位(wei)的方法包括但不(bu)限(xian)于以(yi)下(xia)三種(zhong):
熒光法:利(li)用抗(kang)原(yuan)與的特異性(xing)結合,在細(xi)胞內產生熒光標記,從而(er)確定細(xi)胞內抗(kang)原(yuan)的分布位置。
GFP融(rong)合蛋(dan)白表(biao)達(da)(da)法:將目(mu)的蛋(dan)白與綠色熒光蛋(dan)白(GFP)融(rong)合,通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋(dan)白的表(biao)達(da)(da)位(wei)置。
亞細胞分離法:通過一定的物理或化學方法,將細胞進行破碎,然后通過離心、密度梯度離心等方法將細胞器分離出來,再對分離出來的各個細胞器進行成分和結構分析。
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