菌落的裂解及DNA結合于纖維素(su)濾膜

（1） 在一(yi)張保鮮(xian)膜(mo)上(shang)制(zhi)作一(yi)個(ge)裝(zhuang)有0.5mol/L NaOH的小洼(wa)（0.75ml），使(shi)菌落面朝上(shang)，將濾(lv)膜(mo)放到小洼(wa)上(shang)，展平保鮮(xian)膜(mo)，原位(wei)雜(za)交檢測(ce)，使(shi)濾(lv)膜(mo)均勻(yun)濕(shi)潤，讓濾(lv)膜(mo)留于(yu)原處(chu)2-3分鐘。

（2） 用干紙巾從濾膜(mo)(mo)的下方吸干濾膜(mo)(mo)，染色體熒光原(yuan)位雜(za)交(jiao)，用一張新(xin)的保鮮(xian)膜(mo)(mo)和(he)新(xin)配制的0.5mol/L NaOH重復(fu)步驟（1）。

（3） 吸(xi)干濾(lv)膜(mo)，將(jiang)濾(lv)膜(mo)轉移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保鮮膜(mo)洼上(shang)。5分鐘后(hou)吸(xi)干濾(lv)膜(mo)，再(zai)重復(fu)一(yi)次該步驟。

（4） 吸干(gan)濾(lv)膜(mo)，把(ba)它(ta)轉(zhuan)移到(dao)(dao)有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4）的(de)保鮮膜(mo)小洼上5分鐘(zhong)后吸干(gan)濾(lv)膜(mo)，轉(zhuan)移到(dao)(dao)一張(zhang)干(gan)的(de)濾(lv)紙(zhi)上，置于室溫(wen)20-30分鐘(zhong)，使濾(lv)膜(mo)干(gan)燥。

（5） 將濾膜夾在兩張干的濾紙(zhi)之(zhi)間，在真空烤箱中于80℃干烤2小時，固定DNA。

（6） 將固定在膜上的DNA與32 P標記的RNA進行雜交。

這一原理對于檢測一個特異的mRNA在某一種生物體，或者某些組織切片、單個細胞里具體表達位置非常有用。該技術早應用于60年代末期，由于核酸分子雜交的特異性高，并可定位，因此該技術已被廣泛應用，例如與細胞內RNA進行雜交以觀察該組織細胞中特定基因表達水平。原位雜交能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對于那些細胞數量少且散在于其他組織中的細胞內DNA或RNA研究更為方便；同時由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細胞的形態，更能準確地反映出組織細胞的相互關系及功能狀態。

將32 P標記的(de)雙鏈DNA探(tan)針(zhen)于100℃加熱5分鐘(zhong)，熒光原(yuan)位雜(za)交(jiao)(jiao)，迅速置于冰浴中(zhong)(zhong)。單(dan)鏈探(tan)針(zhen)不必變性。將探(tan)針(zhen)加到雜(za)交(jiao)(jiao)袋中(zhong)(zhong)雜(za)交(jiao)(jiao)過夜。雜(za)交(jiao)(jiao)期間，盛(sheng)濾膜的(de)容器(qi)應蓋嚴，原(yuan)位雜(za)交(jiao)(jiao)，以防液體蒸發(fa)。

雜(za)交結束后，去除雜(za)交液(ye)，立即于室溫把濾膜放入大體積(ji)（300-500ml）的2×SSC和(he)0.1% SDS溶(rong)液(ye)中，輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至(zhi)少翻轉一次。重(zhong)復(fu)洗 一次，同時應避免(mian)膜干涸(he)。

68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進行自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。

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