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熒光原位雜交技術-原位雜交-武漢貝科新肽公司

||| 產品編號:595804561                    更新時間:2025-04-16
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原位雜交第三天

1) ? ? ? ?用(yong)(yong)1ml含10%熱(re)滅清的MABT溶液(ye)置(zhi)(zhi)換(huan)溶液(ye),放置(zhi)(zhi)搖(yao)床(chuang)上(shang)(shang)25分(fen)鐘(zhong)(zhong),然(ran)后用(yong)(yong)1mlMABT置(zhi)(zhi)換(huan),25分(fen)鐘(zhong)(zhong),原位雜(za)交技術服務,再用(yong)(yong)1mlMABT溶液(ye)置(zhi)(zhi)換(huan),一小時以上(shang)(shang),后用(yong)(yong)1mlMABT溶液(ye)置(zhi)(zhi)換(huan),25分(fen)鐘(zhong)(zhong)。

2) ? ? ? ?用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次,每次放(fang)置五分鐘。

3)將胚胎轉入十(shi)六孔板(ban)中,吸去staining buffer,加(jia)上300ul BM Purple AP Substrate(底物,用之前加(jia)5mM左旋米唑),十(shi)六孔板(ban)外面包上錫箔(bo)紙以避光,避免(mian)搖(yao)動,室溫(wen)下顯色。

4)每隔(ge)一小時觀察胚胎是否(fou)開始顯色

5)將(jiang)顯色完(wan)全(quan)的(de)胚(pei)胎(tai)中的(de)底物(wu)吸出,用(yong)PBST洗兩(liang)三次后加上4%多聚甲(jia)醛固定,拍照。

6)4C冰箱保存。

在ISHH,整個實驗周期是比較長的,熒光原位雜交技術,實驗程序也比較繁雜,而雜交在ISHH整個實驗中可被認為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細胞或組織與其內的靶核苷酸相結合。因此,雜交是ISHH中關鍵的而且是重要的一個環節。雜交是將雜交液滴于切片組織上,加蓋硅化的蓋玻片,防止孵育過程中的高溫(50℃左右)導致雜交液的蒸發。為保證雜交所需的濕潤環境,可將其放在盛有少量5×SSC或2×SSC(standard saline citrate, SSC)溶液的硬塑料盒中進行孵育。雜交液的成分和預雜交液基本相同,原位雜交,所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖。

將32 P標記的雙鏈DNA探(tan)針于100℃加熱(re)5分鐘,迅速置于冰浴中。單(dan)鏈探(tan)針不必變性。將探(tan)針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期(qi)間,盛濾膜的容器應蓋嚴,以防液體蒸發。

雜(za)交(jiao)結束后,去除雜(za)交(jiao)液(ye),立即(ji)于室溫把濾膜(mo)放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液(ye)中(zhong),輕(qing)輕(qing)振搖5分鐘,并將濾膜(mo)至少翻轉一(yi)次。重復洗 一(yi)次,植物原位雜(za)交(jiao),同時(shi)應避免(mian)膜(mo)干涸(he)。

68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。

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