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原位雜交第三天
1) ? ? ? ?用(yong)(yong)1ml含10%熱(re)滅清的MABT溶液(ye)置(zhi)(zhi)換(huan)溶液(ye),放置(zhi)(zhi)搖(yao)床(chuang)上(shang)(shang)25分(fen)鐘(zhong)(zhong),然(ran)后用(yong)(yong)1mlMABT置(zhi)(zhi)換(huan),25分(fen)鐘(zhong)(zhong),原位雜(za)交技術服務,再用(yong)(yong)1mlMABT溶液(ye)置(zhi)(zhi)換(huan),一小時以上(shang)(shang),后用(yong)(yong)1mlMABT溶液(ye)置(zhi)(zhi)換(huan),25分(fen)鐘(zhong)(zhong)。
2) ? ? ? ?用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次,每次放(fang)置五分鐘。
3)將胚胎轉入十(shi)六孔板(ban)中,吸去staining buffer,加(jia)上300ul BM Purple AP Substrate(底物,用之前加(jia)5mM左旋米唑),十(shi)六孔板(ban)外面包上錫箔(bo)紙以避光,避免(mian)搖(yao)動,室溫(wen)下顯色。
4)每隔(ge)一小時觀察胚胎是否(fou)開始顯色
5)將(jiang)顯色完(wan)全(quan)的(de)胚(pei)胎(tai)中的(de)底物(wu)吸出,用(yong)PBST洗兩(liang)三次后加上4%多聚甲(jia)醛固定,拍照。
6)4C冰箱保存。
將32 P標記的雙鏈DNA探(tan)針于100℃加熱(re)5分鐘,迅速置于冰浴中。單(dan)鏈探(tan)針不必變性。將探(tan)針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期(qi)間,盛濾膜的容器應蓋嚴,以防液體蒸發。
雜(za)交(jiao)結束后,去除雜(za)交(jiao)液(ye),立即(ji)于室溫把濾膜(mo)放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液(ye)中(zhong),輕(qing)輕(qing)振搖5分鐘,并將濾膜(mo)至少翻轉一(yi)次。重復洗 一(yi)次,植物原位雜(za)交(jiao),同時(shi)應避免(mian)膜(mo)干涸(he)。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
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