預雜交

1）每(mei)個管中置(zhi)換(huan)成大約300ulHYB－溶液，60℃水浴(yu)5分(fen)鐘(zhong)，避(bi)免振蕩(dang)。

2）用(yong)等體(ti)積的(de)HYB＋取代HYB－。

3）60℃水浴，預雜交4小時(shi)以上。

雜交

1）吸去預雜交的HYB＋，原位雜交公司，加上100ul已(yi)加入探針的HYB＋溶液（探針濃度約為1ng/ul）..

2）60℃ 溫(wen)浴過夜。

注：雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。

一. 原位雜交天

1. 重新水化(hua)和固定

1） 吸取固(gu)定(ding)好的(de)(de)胚胎，加入50%的(de)(de)PBST溶(rong)液(ye)，放置(zhi)5分鐘。

2） 置換成30％的PBST溶(rong)液，放置5分鐘

3） 置(zhi)換成PBST溶液，原位(wei)雜交(jiao)技術(shu)，放置(zhi)5分鐘(zhong)，重復一次

4） 置(zhi)換成4％多聚甲醛的(de)PBS溶液(ye)固定20分鐘

5） 用PBST洗兩次(ci)，每(mei)次(ci)放(fang)置五分鐘(zhong)，室溫。

蛋(dan)白酶處(chu)理與(yu)后固定（本實驗不做此步）

1） 用10ul/ml的(de)(de)(de)蛋白酶(mei)K在室(shi)溫下處(chu)理(li)胚(pei)胎(tai)。5體節以下的(de)(de)(de)胚(pei)胎(tai)不(bu)處(chu)理(li)，5體節到24小時的(de)(de)(de)胚(pei)胎(tai)處(chu)理(li)3分鐘，24小時以上(shang)的(de)(de)(de)胚(pei)胎(tai)處(chu)理(li)5分鐘或者更長。發育時間越短的(de)(de)(de)胚(pei)胎(tai)越嫩，可以不(bu)用或者少(shao)用蛋白酶(mei)處(chu)理(li)，發育時間長的(de)(de)(de)胚(pei)胎(tai)就需要用蛋白酶(mei)來疏(shu)松組織，以便于雜交。

2） 用PBST溶液(ye)輕洗，在PBST中放置5分鐘。

3） 用4％多(duo)聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，湖北原位雜交，室溫。

4） 用(yong)PBST洗(xi)兩次(ci)，每次(ci)放置五分鐘，室溫。

菌落的裂解(jie)及(ji)DNA結合于纖(xian)維(wei)素濾膜

（1） 在一(yi)張(zhang)保鮮膜上制作(zuo)一(yi)個裝(zhuang)有0.5mol/L NaOH的(de)小(xiao)洼(wa)（0.75ml），使(shi)菌(jun)落面朝上，將濾膜放到小(xiao)洼(wa)上，展平保鮮膜，使(shi)濾膜均勻濕潤，讓濾膜留于(yu)原處2-3分鐘。

（2） 用(yong)干紙巾(jin)從濾膜(mo)的下方吸(xi)干濾膜(mo)，用(yong)一(yi)張新的保鮮膜(mo)和(he)新配(pei)制的0.5mol/L NaOH重復步驟（1）。

（3） 吸(xi)干(gan)濾(lv)膜(mo)(mo)，將濾(lv)膜(mo)(mo)轉移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保(bao)鮮膜(mo)(mo)洼(wa)上。5分鐘后吸(xi)干(gan)濾(lv)膜(mo)(mo)，再重復一(yi)次該步驟。

（4） 吸干濾(lv)(lv)膜(mo)(mo)，把它(ta)轉(zhuan)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4）的(de)保鮮膜(mo)(mo)小洼上5分鐘(zhong)(zhong)后(hou)吸干濾(lv)(lv)膜(mo)(mo)，轉(zhuan)移到一張干的(de)濾(lv)(lv)紙上，置于室(shi)溫(wen)20-30分鐘(zhong)(zhong)，使濾(lv)(lv)膜(mo)(mo)干燥。

（5） 將濾膜夾在兩(liang)張干的濾紙之間，在真空烤箱中于(yu)80℃干烤2小時，固定DNA。

（6） 將固定在膜上的DNA與32 P標記的RNA進行雜交。